DNA Replication (DNA 複製)

階段	比較項目	原核生物 (E. coli)	真核生物

起始 (Initiation)	辨認起始位點	DnaA 結合至 oriC 序列 (245 bp, AT-rich)	ORC (Origin Recognition Complex) 結合至 ARS
	解旋 (Helicase)	DnaB (DnaC 協助)	MCM complex (2-7) (CDC6 / CDT1 協助)
	引子合成 (Primase)	DnaG 合成 RNA primer	DNA Pol α
	拓撲結構解鎖	Gylase (Topo II) 減少 (+)，增加 (-) 超螺旋	Topo I、Topo II
	防止再複製	Dam methylase： OriC 的 5'-G==ATC (MMR 後) (Adenine-N6== methylation)	Geminin 封鎖 CDT1 防止 Pre-RC 再次組裝

延長 (Elongation)	主要合成酶	DNA Pol III	DNA Pol ε (L==e==ading) DNA Pol δ (Lagging)
	單鏈保護	SSB (ssDNA binding protien)	RPA (Replication protein A)
	滑動鉗	β-clamp (γ -complex 裝載)	PCNA (RFC 裝載)
	連接岡崎片段	DNA Ligase (需 NAD+)：具 Lys，需 AMP 共價催化 (Adenylylation of DNA Ligase)	DNA Ligase (需 ATP)：催化模式同原核
	引子移除	DNA pol I (移除 + 填補)	移除：RNase H + FEN1 填補：DNA Pol δ

終止 (Termination)	終止位點	Tus-Ter complex： ==Tus 蛋白==結合 Ter sequences 在 Ter site 阻擋複製叉	無特定終止序列複製叉相遇即融合
	拓撲結構解鎖	Topo IV 分離複製完成的兩組 DNA (catanane)	Topo II 協助線性染色體分離
	末端問題	無 (環狀 DNA 無末端)	Telomere 縮短需 Telomerase 修復

Pre-replicative complex (Pre-RC)

Pre-RC 組裝：
- 只在 G1 phase，ORC, CDC6, CDT1, 協助兩個 MCM2-7 組裝
- 組裝過程為 ATP-dependent：
  - ORC, CDC6, MCM 屬於 AAA+ATPase family
  - ORC, CDC6 具有 molecular chaperone 功能 → 協助 MCM 正確組裝
  - MCM 組裝正確後，ATP 才可順利水解，使裝載完成，啟動後續流程
- 共同組成 Pre-Pc double Hexamer
Pre-RC 活化：
- 在 S 期被 S-CDK 等磷酸化
- MCM2-7 活化，解旋 DNA，開啟 elongation
阻止 Pre-RC 再組裝：
- 避免 DNA 重複複製
- S-CDK：磷酸化 CDC6 / CDT1 使其降解、離開細胞核
- Geminin：
  - 封鎖 CDT1 (MCM 穩定嚮導)，使其無法與 MCM 結合
  - Geminin 只在 G1 不活化 → Pre-RC 只能在 G1 phase 組裝

DNA 複製四大特性：
- Semiconservative (半保留)：
  - 分離的兩股各自作為新股模板，合成新股
  - 利用==無放射性的 ¹⁵N== 驗證
  - 複製前後懸浮位置不同：¹⁵N-¹⁵N 最重，¹⁵N-¹⁴N 次之，¹⁴N-¹⁴N 最輕
- Bidirectionally (雙向複製)：
  - 從複製起點 Origin (Ori) 解旋產生複製泡
    - Origin (Ori) 位於複製泡
    - Ori 為 AT-rich 序列，氫鍵較少，容易解旋
  - 兩端形成動態分叉口 (Replication fork) 分頭複製
- 5' → 3' Direction (方向性)：
  - 新股合成的方向固定由 5' → 3'
  - 上一個 dNTP 的 3'-OH 攻擊下一個 dNTP 的 5'-α-Phosphate
    - 形成 Phosphodiester bond
    - 剩下的 Biphosphoate (β, γ) 將被 Pyrophosphatase 分解成 2 Pi
    - Pyrophosphatase 可協助推動 DNA / RNA 合成 (使 rxn 向右)
- Semidiscontiuous (半不連續性)：
  - 為遵守方向性，一股連續合成，一股分段合成
    - Leading strand：
      - 連續合成，又稱 contiuous strand
      - 合成==較早開始，但與延遲股合成速度相同==
    - Lagging strand：
      - 分段合成，又稱 discontiuous strand
      - 合成==較晚開始，但與領先股合成速度相同==
  - Okazaki fragments：
    - Lagging strand 的合成片稱為岡崎片段
    - 所有生物皆有 (病毒無)

Hunane genome 組成比例

Protein-coding gene：
- Exon：佔比 1.5 %
Non-protein-coding gene：
- Intron：佔比 25 %
- Transposon：佔比 45 %
  - Class I： Retrotransposons (42%)
    類似困在細胞內的病毒，目的是增加自己的 gene copy
    - LINEs
    - SINEs：Alu elements 屬於此類
    - LTR retrotransposons
  - Class II：DNA transposons (3%)

Transposon 分類

原核生物 DNA 複製 (E.coli)：

階段	原核生物 (E. coli)	功能

起始 (Initiation)	DnaA	辨認起始位點：結合 ori 序列 (245 bp, AT-rich)
	DnaB	Helicase：解旋 DNA (由 DnaC 協助)
	DnaG	Primase：合成 RNA primer
	Gylase (Topo II)	拓撲結構解鎖：增加 (-) supercoil，減少 (+)
	Dam methylase	防止再複製、區分新舊股： Ori 的 5'-G==ATC 甲基化 (Adenine-N6== methylation)

延長 (Elongation)	DNA Pol III	主要合成酶 (多次單元) β-clamp 在 DNA 上滑動 (clamp 由 γ -complex 裝載)
	SSB (ssDNA binding protien)	單鏈保護：保護 ssDNA 結構
	DNA Ligase	連接岡崎片段：具 Lys，需 AMP 共價催化 (需 NAD+) (Adenylylation of DNA Ligase)
	DNA pol I	引子移除

終止 (Termination)	Tus-Ter complex	終止複製：==Tus 蛋白==結合 Ter sequences 在 Ter site 阻擋複製叉
	Topo IV	分離複製完成的兩組環狀 DNA (catanane 結構)

特徵	DNA Pol I	DNA Pol II	DNA Pol III
5'→3' Polymerase (DNA 聚合)	有	有	有
3'→5' Exonuclease (Proofreading)	有	有	有
5'→3' Exonuclease (Primer 切除)	有	無	無
主要角色	移除 primer 置換為 DNA	DNA 修復重啟複製	DNA合成主力
Processivity (一次結合之合成數量)	低 (切完 primer 就掉下來)	中	極高 (一次跑幾萬個 bp)
分子結構	單一肽鏈三級結構	單一肽鏈三級結構	多次單元，四級結構 Holoenzyme

DNA pol lII 的次單元

| 功能區塊 | Subunits | 主要功能 (Function) |
| :------------------------------------: | :-----------------------------------: | :------------------------------------------------------------: |
| Core Enzyme | $α$ | 聚合活性 (5'→3' Polymerase) |
| | $ϵ$ | 校正活性 (3'→5' Exonuclease) |
| | $θ$ | 穩定 $ϵ$ 次單元 |
| β-clamp
(Sliding Clamp) | $β$ | 提高 Processivity
β-clamp 把酶鎖在 DNA 上，防止脫落 |
| γ-complex | $γ, δ, δ^{'}, χ, ψ$ | 打開 β-clamp 並套在 DNA 上 (Clamp Loader) |
| Dimerization | $τ$ | 將分別處理 Leading / Lagging stand 的兩 $α ϵ θ$ 結合在一起 |

Nick translation 與 DNA pol I 活性

DNA Pol I 經蛋白酶切割可分成大小兩片段，Nick translation 需整合兩片段的活性
Nick translation 包含 Primer 移除 + DNA 加入，單一片段不具有 Nick translation 能力
| 片段名稱 | 包含端點 | 包含活性 | Domain 功能 |
| --------------------------------------------------- | ------------------ | -------------------------- | --------------------------- |
| Small Fragment | N-terminal | - 5'→3' Exo | Primer 移除 |
| Large Fragment
(Klenow Fragment) | C-terminal | - 5'→3' Pol
- 3'→5' Exo | 聚合：加入核苷酸
校正：Proofreading |
每一個 Okazaki fragment 的 5' 端皆有 RNA primer，此處的 DNA 由 Pol I 合成
- Pol I 邊切除 primer，邊加入 DNA → Nick 移動
- 5'-|ddddddd| |rrrrrrrrr|dddddddddddddddd|-3
- 5'-|dddddddddd| |rrrr|dddddddddddddddd|-3'
- 5'-|ddddddddddddd| |dddddddddddddddd|-3'

Trombone fashion (長號模型)

真核、原核皆使用此模型
DNA 的 Leading / Lagging strand 各自有 Core Enzyme 催化
兩 Core enzymes 透過 $τ$ subunit 連結成 dimer，同時催化 DNA 合成
藉由 Lagging strand looping (形成迴圈)，使其與 leading strand 能「同向」合成 DNA
Leading strand：連續合成
- Helicase 在前方解旋，Core enzyme 順順的向前合成，不需反覆裝載
Lagging strand：重複換軌 (clamp)
- 合成一段岡崎片段後，Core enzyme 撞到前一段合成的片段
- 構型改變導致其與原本的 $β$ -clamp 的親和力下降
- Core enzyme 自動鬆脫，快速回彈至下一個預裝好的 clamp 處，繼續下一段複製

Pre-RC 組裝：

Pre-RC 活化：

阻止 Pre-RC 再組裝：

DNA 複製四大特性：

Semiconservative (半保留)：

Bidirectionally (雙向複製)：

5' → 3' Direction (方向性)：

Semidiscontiuous (半不連續性)：

原核生物 DNA 複製 (E.coli)：